MILE米乐人胚肺成纤维细胞MRC5培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人胚肺成纤维细胞MRC5

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：MEM+10%FBS+1%NEAA+1%丙酮酸钠+1%L-谷氨酰胺+1%P

传代方法：首次建议使用1:2的比例进行传代

传代情况：每2天换液

备注：使用无菌离心管收集瓶子内的培养基，留作过渡对比培养。如果对比培养效果不佳，建议直接购买我们的完善培养基

二、细胞接收后的处理

接收到细胞后，将其培养至良好状态，然后灌满完全培养液并密封瓶口，这被认为是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，之后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，建议拍摄不同倍数的照片保存（最好40x、100x及200x各一张），前三天的照片将作为重要的售后依据。如果未提供照片，将默认收到的细胞状态良好。

（在传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养，并在换液后将瓶盖稍微拧松）

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

如果细胞的汇合度未超过80%，将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml的完全培养基，并放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。如果细胞密度超过80%，即可进行传代培养，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，之后在显微镜下观察细胞的消化情况；若细胞大部分变圆并脱落，迅速将培养瓶移至操作台，轻敲几下瓶身，然后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，悬液转移至15ml离心管中，以1000RPM的速度离心5分钟，弃去上清液，补充1-2ml完全培养基重悬。
4. 按照1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞是否回缩变圆；待细胞状态良好后，加入5ml完全培养液终止消化。轻轻吹打细胞使其脱落后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，令细胞沉淀后加入1ml的MILE米乐无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接置入-80℃冰箱中；若后期要转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转移。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速将其放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后使用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，将细胞沉淀用5ml完全培养基重悬，然后接种至T25培养瓶中，放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天，换用新鲜的完全培养基进行培养。

四、注意事项

一些细胞在贴壁时不够牢固，运输过程中可能会发生细胞脱落，这是正常现象。如果脱离的细胞数量较多，可以将所有培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养（后期用于对比培养），然后加入1-2ml胰酶轻轻吹打，重悬后消化1-2分钟，最后加入5ml完全培养基终止反应。再次离心，弃去上清后补加1-2ml完全培养基重悬。之后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱继续培养。

五、售后条款

1）如细胞出现问题可以重发的情况包括：

1. 运输途中发生细胞丢失、瓶身破损或培养液严重漏液，均可重发。
2. 细胞污染问题，请在收到产品48小时内提供真实的实验结果，若核实后属实可重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内，大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可重发。
4. 干冰冻存发货的细胞在复苏后的24小时内或常温发货的细胞静置4小时后未开封出现污染的情况，可重发。
5. 细胞活性问题，请在收到产品7天内提供真实的实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后可重发。
6. 细胞收到当天及第二、第三天均需拍照，若超过三天未告知，视为产品合格。4-7天内出现问题的需提供收到细胞前三天照片及出现问题时的照片，并与技术人员沟通，由技术人员判定责任，重发。

2）细胞出现问题不予重发的情况包括：

1. 客户造成的细胞污染不予重发；
2. 因客户操作不当导致细胞状态不好不予重发；
3. 使用非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不良的不予重发；
4. 细胞状态不良，未提供细胞培养前三天照片的不予重发；
5. 细胞培养过程中有其它处理的不予重发；
6. 细胞收到2天内未告知的情况不予重发；
7. 其他情况以具体情况而定。

选择MILE米乐，让您的细胞培养更加安全、高效！