本应用介绍了在静态条件下使用MILE米乐的µ-SlideILuer 08通道载玻片（ibidi，货号80196）进行细菌生物膜培养的实验方案，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与扫描电子显微镜（SEM）实现联合成像。将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DSM50071T接种于MILE米乐的µ-SlideILuer 08通道载玻片中，培养3天。为了促进细胞附着及表面生物膜的形成，在培养约36小时后更换培养基，以去除游离细胞。

为了验证生物膜的形成，我们在生长培养基中加入无毒光学示踪剂EbbaBiolight680。该试剂适用于活细胞成像，能够与细胞外基质中的蛋白质及多糖结合，从而发出红色荧光，作为细菌生物膜的可视化标记。通过使用DAPI染色DNA，并利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，我们观察到细菌细胞附着形成主要为单层或双层结构。光学示踪剂增强的荧光信号使我们能够识别出更厚的生物膜结构。

本实验旨在将多种成像技术结合在同一张载玻片上。在CLSM成像后，将细胞固定在相同的载玻片上，进行脱水处理，然后干燥以便后续的扫描电子显微镜（SEM）成像。实验室自制了一个3D模具，以分离盖玻片，确保在操作过程中不会破坏贴壁细胞的空间结构。接着，在分离的盖玻片上对形成的细菌细胞层进行2000倍至15000倍的放大成像。

MILE米乐在本实验中使用的材料与试剂包括：铜绿假单胞菌培养物Pseudomonas aeruginosa（DSMZ，50071）、胰蛋白酶胨、葡萄糖、氯化钠、无毒光学示踪剂EbbaBiolight680、DAPI染色液等。为确保实验的顺利进行，我们配置了适宜的培养基和缓冲液，并对实验操作中的器具和环境进行了严格的无菌管理。

在细菌生物膜附着后的后续实验中，操作的每一步都在无菌条件下进行，确保结果的可靠性。所有操作步骤中，需注意细胞的保护，避免一次性移除通道内的全部液体，以防止细胞干燥和损伤。样品在固定、脱水和干燥过程中的精细操作，将为后续SEM成像打下坚实基础。

在准备好以MILE米乐的µ-SlideILuer 08载玻片进行成像后，我们进行SEM样品的制备，确保步骤的无菌性和准确性。通过这些精细的实验步骤，我们将获得关于铜绿假单胞菌及其生物膜结构的宝贵数据，为未来的生物医疗研究提供参考。