细胞融合是一种重要的生物技术，常用的方法包括物理法（如电融合、激光融合）、化学融合法和生物融合法（如灭活的仙台病毒）。在化学融合法中，聚乙二醇（PEG）法是一种常用的方式。聚乙二醇的分子量在200至700之间时，呈无色、无臭的粘稠液体；当分子量超过1000时，则呈乳白色蜡状固体。聚乙二醇具有良好的水溶性，能够溶解于水、乙醇及多种有机溶剂，并对热较为稳定，与许多化学药品反应不明显。

作为细胞融合剂，常选择分子量为4000的聚乙二醇，通常配制为50%浓度，pH在8.0至8.2之间（可用10% NaHCO3调整）。较小分子量的PEG效果较差且具有一定毒性，而过大的分子量则会造成高粘度，操作困难。因此，50%的浓度和偏碱的pH环境有助于实现最佳的融合效果。此外，也可以使用30%至50% PEG与10%二甲亚砜的组合进行细胞融合。

在选择聚乙二醇时，不同批次的PEG即使具有相同的分子量，其融合率可能存在显著差异，因此在使用之前需要进行细胞毒性测试。同时，建议选购高纯度的PEG，特别是用于气相色谱的产品。

在细胞融合的操作过程中，常见的方法包括转动法和离心法，通常将脾细胞与骨髓瘤细胞以1:1至10:1的比例混合。最常用的比例为3:1或5:1。以下是操作步骤：

1. 准备试剂与材料：

• 供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞
• 1640培养液100ml
• 完全1640液100ml
• 25% FCS-1640液50ml
• HAT培养液100ml
• 50% PEG：将高纯度分子量为4000的PEG 10g在25ml瓶中高压灭菌，使用前与预热至40℃的1640液10ml等量混合，如有必要可用HCl或NaHCO3调整pH
• 灭菌沉淀管或瓶（10ml和50ml）
• 40孔塑料培养盘

2. 操作步骤：

1. 准备脾细胞。
2. 在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，加入50ml的25% FCS-1640液。
3. 在室温下以400g的速度离心3分钟，使细胞沉淀。
4. 移除上清液。
5. 轻敲管底部，令沉淀流动，将沉淀管放置在40℃水浴中以达到融合温度。
6. 慢慢滴加预热至40℃的50% PEG 8ml，边加边摇动沉淀管，观察到颗粒形成，滴加过程持续2分钟。
7. 接着加入1ml 1640液，边加边摇动，持续1分钟。
8. 重复以上步骤。
9. 随后再加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟，重复一次。
10. 加入1640液15ml。
11. 室温下，400g离心1分钟使细胞沉淀。
12. 去除上清液，轻敲管底部，加入25ml含有HAT的完全1640液。
13. 向已种植有饲养细胞的40孔塑料培养盘中，每孔滴加融合的细胞液1滴（约0.05ml）。
14. 轻摇后，将其放置在5% CO2和湿度饱和的37℃培养箱中。
15. 在第3、6、9和10天更换为含HAT的完全1640培养液，注意轻吸上清液，避免吸入固定在孔底的细胞。
16. 在第12和15天再加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前，利用倒置显微镜观察，通常在10天左右可观察到杂交瘤细胞的生长。
17. 在出现杂交瘤细胞后，检查抗体并进行增殖传代。在传代过程中，根据需要可用10% FCS-1640液替代HAT液和完全1640液，并保持在液氮中进行克隆化，每代都要检查抗体，以防抗体产生细胞的变异与丢失。

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