大鼠肝星形细胞THSC培养说明书

一、细胞培养条件

MILE米乐大鼠肝星形细胞THSC的生长特性与培养条件详见如下：

• 细胞名称：大鼠肝星形细胞THSC
• 冻存条件：无血清冻存液
• 培养体系：DMEM
• 传代方法：推荐第一次按1:2比例进行传代
• 传代情况：每2天更换培养基

备注：使用无菌离心管收集培养基，以便进行过渡对比培养。如对比效果不理想，建议直接购买MILE米乐的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，请将其培养至良好状态，并用完全培养液灌满瓶口并封好。对此，请遵循以下步骤进行操作：

• 使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后在超净台内进行严格的无菌操作。
• 将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱静置3-4小时，以稳定细胞状态后进行后续处理。
• 在显微镜下观察细胞生长情况，并对不同倍数拍照保存（建议40x、100x、200x各一张），前三天的照片为重要的售后依据。如未提供照片，默认收到状态良好。
• 传代时，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自行配制的完全培养基，以便于对比培养，并在换液后拧松瓶盖。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞未达到80%汇合度时，需将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并放入37℃、5%CO2孵箱培养；当细胞密度超过80%时即可进行以下传代步骤：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次洗涤。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态后立即加入5ml完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落，吸出并转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清液后补加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察至细胞变圆后添加5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打并转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，加入1ml MILE米乐无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如需转入液氮罐，需先在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护装备），迅速置于37℃水浴中解冻直至无结晶，随后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将细胞转移至含5ml完全培养基的离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，补加5ml完全培养基重悬，并接种于T25培养瓶，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因贴壁不牢而出现脱落现象，这是正常的。如脱落较多，可将全部培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，整理并处理。凑合后加入胰酶，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入完全培养基终止反应，随后重复离心并补加培养基进行重悬。再按1:2比例进行传代（两个T25瓶），并加入新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1) 细胞出现问题可重发的情况

若细胞在运输过程中遇到问题，如丢失、瓶身破损、培养液漏液等，可申请重发；细胞污染的情况，请在收到产品48小时内提供实验证明，经过核实后即可重发；常温发货细胞在静置24小时后，或干冰运输细胞复苏后的24小时内，绝大多数细胞若未存活，需提供真实清晰的细胞状态照片进行重发；如细胞复苏后24小时内或未开封的常温发货细胞静置4小时出现污染，也可申请重发。如细胞活性问题需在收到产品7天内提供使用台盼蓝染色法鉴定的结果，经过核实后重发。

2) 细胞出现问题不予重发的情况

若因客户原因导致细胞污染，或因操作不当致使细胞状态不佳，或使用非MILE米乐推荐的细胞培养体系导致细胞问题，均不予重发。同时，如果未提供细胞培养前3天的照片，或在收到后2天内未告知问题，亦不予重发。具体情况可根据实际而定。